前言：

目前，科學家們在干細胞的研究上不斷的獲得成績，總結(jié)世界的研究報道，其干細胞研究方法有三大類，其一類是胚胎或成體干細胞體外組織培植移植技術研究系統(tǒng)；其二類是體外胚胎或成體干細胞的單細胞培植移植技術研究體系；其三是體內(nèi)干細胞原位組織培植技術研究體系。前兩者的醫(yī)學目標是通過移植體外培植的干細胞或組織器官，達到治療器官組織損傷性疾病的目的；后者是作者發(fā)明建立的技術研究體系，醫(yī)學目標是通過激活和調(diào)動器官組織原位局部的干細胞潛能，原位再生組織和器官，直接再生修復和修補損傷的組織器官，達到治療器官組織損傷的目的。本報告專題介紹在深度燒傷創(chuàng)面上如何原位培植表皮角蛋白19型干細胞的技術程序情況。敬供大家參考。

什么叫原位干細胞培植？

原位干細胞是指：體內(nèi)組織器官局部存在的干細胞和具有干細胞潛能的特殊組織細胞。其特點是存在于成體器官組織中，可轉(zhuǎn)化為更原始和增殖能力的細胞；可直接在器官組織中再生為具有與原組織相同功能和結(jié)構(gòu)的器官組織；其組織與原有器官組織再生為一體。實現(xiàn)這一原位組織修復技術的技術稱原位干細胞培植技術。

材料與方法：

1、 深度燒傷創(chuàng)面：A、干細胞標記實驗創(chuàng)面：下肢深度燒傷；B、臨床重復創(chuàng)面：面部深度燒傷。

2、 干細胞標記實驗方法：選角蛋白19型表皮干細胞作為特異陽性干細胞。實驗方法是用小鼠單克隆抗體放射性免疫熒光技術。

3、 臨床床技術：無損傷液化排除壞死皮膚技術和創(chuàng)面活組織培養(yǎng)技術(MEBT)。

4、 細胞培植物質(zhì)，創(chuàng)面全營養(yǎng)培養(yǎng)基(MEBO-2)。

角蛋白19型表皮干細胞跟蹤：

方法：在皮膚深度即時燒傷(傷后2小時內(nèi))，立即取創(chuàng)面深部活組織，和創(chuàng)面周圍未燒傷區(qū)皮膚活組織，低溫冰凍儲存；待進行放免組織細胞的角蛋白19型表皮干細胞檢查。而后立即行MEBT和MEBO-2治療。分別在第24小時、第四天、第七天、第十四天、第十七天、第二十一天、第二十八天，取創(chuàng)面下的活組織，方法同上，檢查其角蛋白19型陽性的細胞。

放免檢查及結(jié)果：

傷后立即取組織進行組織學檢查，確定為全厚皮燒傷(年齡大于25歲)才能入選，同時立即取傷區(qū)活組織和未傷皮膚組織進行放免檢查，未查見角蛋白陽性的19型表皮干細胞；傷后24小時則查見19型表皮干細胞；第7天開始向高峰發(fā)展，第十四天達高峰；而后逐漸減少，到第二十八天，降到最低點；創(chuàng)面第二十八天基本愈合，真皮、表皮修復。(見圖)

面部深度燒傷重復實驗：

1、 面部燒傷半小時(年齡58歲)，立即取創(chuàng)面活組織檢查為全厚皮壞死；(圖)

2、 立即行MEBT療法，將皮膚耕耘至深部活組織，外涂MEBO-2，使MEBO-2 直接滲入到創(chuàng)面下活組織。(圖)

3、 無損傷液化排除壞死皮膚層。(圖)

4、 繼續(xù)培養(yǎng)創(chuàng)面活組織，創(chuàng)面下活組織組織學顯示呈皮膚干細胞增殖生長狀態(tài)。(圖)

5、 繼續(xù)培植創(chuàng)面，見與創(chuàng)面基底生理連接的正常結(jié)構(gòu)皮膚從創(chuàng)面中透出。(圖)

6、 繼續(xù)培植50天，面部正常結(jié)構(gòu)的皮膚原位完全再生。(圖)，原位干細胞原位復制皮膚完成。

臨床擴大實驗：

原位培植皮膚技術治療燒傷，在全身系統(tǒng)外科治療的配合下，已成為重要可靠的大面積燒傷治療技術�，F(xiàn)展示大面積燒傷治療所獲的再生新皮膚的實體狀態(tài)。(圖)

討論：

原位表皮干細胞研究實驗論證說明

1、角蛋白19型表皮干細胞：多種研究一致認為，人的皮膚中的表皮基底細胞、毛囊、腺體中均存在表皮干細胞，有的接近成體細胞，有的仍具有較原始的分化能力，如毛囊中的干細胞。從而人們把這些干細胞按其原始分化能力和角蛋白的表達類型，分多種類型。公認的事實，在正常皮膚中，存有小于角蛋白16型的表皮干細胞。而本課題選定的角蛋白19型表皮干細胞，是皮膚器官組織胚胎形成中的表皮干細胞，在皮膚形成成體器官后，表皮干細胞不再表達為19型。所以，本課題選角蛋白19型作為表達檢查干細胞具有特異性，以區(qū)分其他表皮干細胞。排除其他表皮干細胞的干擾。本實驗證明，用同樣的方法檢查未燒傷區(qū)皮膚組織，未查見角蛋白19型表皮干細胞。以此說明實驗設計的可靠性。

2、活檢組織處理方法，由于本實驗為原位干細胞實驗，不能用細胞傳代的方法進行細胞檢查鑒定，因細胞傳代則無法證明原位細胞的特性，也就是說，對傳代細胞的鑒定不能代表原位細胞的鑒定，兩者有質(zhì)的區(qū)別。本實驗采取對活檢組織立即冰凍、阻止細胞傳代的方法，有其特異的準確性；細胞標本真實；活檢組織的表達與原位細胞一致。

原位培植方法說明

本實驗采取的是一種在燒傷后直接在活組織原位培植表皮干細胞的方法，實現(xiàn)其方法有三個關鍵環(huán)節(jié)，其一、設法盡快在燒傷后將干細胞培養(yǎng)基送到原位；其二、是如何盡快無損傷清除影響表皮干細胞再生的壞死皮膚；其三、如何在創(chuàng)面上原位培植干細胞再生皮膚。這三大技術是培植原位干細胞的關鍵，也是外科醫(yī)生的技術實施水平體現(xiàn)。由于這些技術是專項的臨床應用操作技術，將在另一專題中分別介紹。

MEBO-2的說明

MEBO-2是專門用于培養(yǎng)皮膚的產(chǎn)品，全由營養(yǎng)物質(zhì)組成，具有激活和誘導具有干細胞潛能的細胞增殖的作用，具有調(diào)節(jié)表皮干細胞和成纖維細胞再生增殖的作用；具有創(chuàng)造創(chuàng)面生理微環(huán)境的作用；具有營養(yǎng)保護創(chuàng)面的作用；他是一種由多種天然成分組成的組合物。目前仍在商業(yè)秘密階段。

角蛋白19型表皮干細胞表達規(guī)律

從本實驗結(jié)果表明，全厚皮膚燒傷壞死后，殘存于皮下組織中的具有表皮干細胞潛能的某些組織細胞，可被激活和誘導成角蛋白19型表皮干細胞，而新出現(xiàn)的角蛋白19型干細胞在創(chuàng)面愈合過程中增殖活躍，在創(chuàng)面修復的高峰期，其量也達高峰；而在愈合后期，其量逐漸減少，很可能是19型表皮干細胞已向成體型細胞轉(zhuǎn)化，形成組織所至。在組織切片檢查中證實了這一規(guī)律。關于角蛋白19型干細胞被激活和被誘導的機制及基因表達研究，也將另行報道。

原位表皮干細胞培植技術的科學價值和評價

人體皮膚是最大、功能最多、含器官組織最的多的器官，原位角蛋白19型表皮干細胞的培植成功，不僅給深度燒傷的治療提供了保守治療的新方法，而且給人體原位組織器官的原位干細胞再生技術創(chuàng)出了一條新路。但是本實驗僅報道了表皮干細胞的培植情況，而皮膚器官中的多種細胞組織的培植情況尚待繼續(xù)報道和研究。