[摘 要]：目的：通過體外檢測美寶胃腸膠囊（GIC）對胚胎小白鼠小腸器官型植塊生長的作用以探索GIC修復(fù)粘膜損傷的機理。方法：體外培養(yǎng)胚胎小白鼠小腸器官型植塊，并將所有植塊分為兩組：實驗組和對照組。結(jié)果：實驗組的小腸器官型植塊能很好地維持存活，并有大量的單個細胞、細胞克隆以及片狀粘膜組織塊長出，生長的時間長，生長狀態(tài)好；而對照組的小腸器官型植塊均很快歸于死亡。二者差異極為顯著。結(jié)論：GIC能夠維持胚胎小白鼠小腸器官型植塊的存活，并能促進細胞增殖，某種程度上維持組織的完整性，重新組合成粘膜組織，此結(jié)果可能與GIC激活上皮干細胞有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]：GIC；小腸植塊；生長

GIC Could Maintain Survival and Promote Cell Growth of Organ-Type Explants of Intestine of Mouse Embryo Xu rong-xiang,Wang Yan-ping,Fan Ran,etc。

Central laboratory, MEBO Global Group 100053

[Abstract]： Objective: To research on the reparative mechanism of GIC on intestinal lesion through examining the effect of on the survival and cell growth of organ-type explants of intestinal tissue of mouse embryo. Methods: Cultured the organ-type explants of mouse intestinal tissue in vitro, all the explants were divided into two groups: test group and control group. Results: Explants could survive in test group. Single cells, cell clones and tissue pieces could grew out of the explants and grew long and well　in test group. Conclusion: could maintain survival of intestinal explants and promote growth of cells from intestinal explants of mouse embryo and this process may be involved in the activation of epithelial stem cells.

[Key words]： GIC; intestinal explant ;　growth

　　大量臨床實踐顯示，GIC可能也是通過激活粘膜上皮干細胞、促進組織細胞生長的機理實現(xiàn)對損傷粘膜修復(fù)的，為了證明這一觀點，我們特設(shè)計了本實驗。

　　一. 儀器、設(shè)備、材料、試劑及實驗動物

　　培養(yǎng)箱（美國Forma）、冰箱（江蘇長嶺）、倒置顯微鏡（重慶光學儀器廠）、超級恒溫水浴及恒溫電烤箱（重慶四達）、超凈工作臺（北京半導(dǎo)體設(shè)備二廠）、顯微成像分析系統(tǒng)（上�？迫穑⑽⒉t（廣東Galanz）、微型計算機（北京沐澤）、光學顯微鏡（江蘇光學儀器廠）、各種型號注射器、12孔培養(yǎng)板（丹麥NUNC）、50ml離心管、Eppendorf離心管、微量加樣器（1000μl、200μl、20μl、10μl, 均為法國Gilson）、大小滴頭、玻璃培養(yǎng)皿（φ5cm、φ6cm）、0.22μm微孔濾膜、針頭濾器、顯微外科器械、各種眼科手術(shù)器械、有蓋三角燒瓶、有蓋小試管、針頭、GIC（美寶公司生產(chǎn)）、MEM培養(yǎng)基（美國Hyclone）、胎牛血清（杭州三利）、青霉素和鏈霉素（華北制藥）等。

　　實驗動物：昆明種胚胎小白鼠

　　二. 實驗方法：

　　1．取孕16日齡的昆明雌性小白鼠，頸椎脫臼法處死之，先置于75%乙醇中粗洗一遍（2分鐘），再置于75%乙醇中消毒5分鐘；

　　2．用眼科剪以及止血鉗先剪開雌鼠的腹部皮膚，鈍性分離至兩側(cè)，充分暴露腹壁肌肉，然后小心剪開腹壁全層，切勿傷及內(nèi)臟及小鼠胚胎；

　　3．剪開子宮，從宮腔中取出胚胎鼠，置入無菌平皿中；

　　4．用雙抗-冷PBS將胚胎鼠體表洗滌兩次，每次１分鐘；

　　5．用顯微外科剪刀將胚胎鼠的腹壁剪開，再用顯微外科鑷子夾起鼠近胃端小腸（包括十二指腸和空腸），截取２cm左右；

　　6．用雙抗-冷PBS將胚胎鼠小腸連續(xù)洗滌兩次，每次1分鐘；

　　7．用顯微外科剪刀將腸管縱行切開，充分暴露粘膜面；

　　8．用雙抗-冷PBS將胚胎鼠小腸連續(xù)洗滌兩次，每次1分鐘；

　　9．將鼠小腸置于含雙抗（青、鏈）的MEM培養(yǎng)液中沖洗2次，每次1分鐘；

　　10．將鼠小腸剪成極小的器官型植塊，大小約1mm×1mm；

　　11．將植塊置于12孔培養(yǎng)板的培養(yǎng)孔中央，每孔5塊，間隔約2mm，布局合理，粘膜面向上，輕輕按壓每塊植塊，使其緊貼培養(yǎng)板的表面；

　　12．沿著培養(yǎng)孔的邊緣，每孔中加入約0.5ml的完全MEM培養(yǎng)液，勿使培養(yǎng)液與植塊接觸；

　　13．將培養(yǎng)板置于37，５％培養(yǎng)箱中預(yù)孵育１.5小時；

　　14．每孔加完全MEM培養(yǎng)液2ml，輕拿輕放，切勿使植塊飄起，實驗組加GIC；

　　15．實驗組和對照組同步等量換液，每次去掉原液的1/２左右, 再加入相同量的新鮮MEM培養(yǎng)液；

　　16．用倒置顯微鏡觀察植塊生長情況，用顯微成像記錄分析系統(tǒng)記錄所觀察的結(jié)果，并用計算機保存圖像。

　　三．實驗結(jié)果

　　細胞培養(yǎng)110天內(nèi)的報告結(jié)果：實驗組和對照組的腸組織植塊在培養(yǎng)之初，均能固定在培養(yǎng)孔中央，但隨著培養(yǎng)時間的推移，植塊逐漸脫離培養(yǎng)孔底部平面，游離飄浮于深層培養(yǎng)液中，懸浮的位置仍然靠近培養(yǎng)孔底部，但仍然集中于培養(yǎng)孔中央，少數(shù)位于周邊，植塊的大小和形狀幾乎沒有變化，但在培養(yǎng)的第１０天左右，組織塊就開始變得膨松，然后逐漸裂解為很小的組織塊，并最終成為肉眼不易察覺的組織塊，這時在視野中發(fā)現(xiàn)了單個細胞以及細胞克隆。在培養(yǎng)的第２０天，對照組中的細胞以及細胞克隆逐漸死亡，而實驗組細胞依舊生長良好，單個細胞越來越多，在視野中到處可見，以位于中央部位的最多，細胞圓形，細胞核清晰。細胞呈典型活細胞狀態(tài)。越向外越少，邊緣幾乎沒有，細胞克隆數(shù)也逐漸增多。每個克隆所含有的細胞個數(shù)隨著時間的推移也越來越多。上述結(jié)果說明含15%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基無法提供給組織塊合適而充足的營養(yǎng)，而GIC作為高級細胞培養(yǎng)基能夠提供給細胞合理而充足的營養(yǎng)，保證了組織和細胞的活性。

　　下面為培養(yǎng)過程中，實驗組和對照組的對比圖譜，可以深刻反映兩組的差別。

圖１　培養(yǎng)第24天。圖1A為對照組，圖1B為實驗組。對照組中的小腸組織細胞或細胞克隆已經(jīng)死亡，實驗組中顯示的是大量單個的小腸組織細胞，但其中沒有克隆。
圖2　培養(yǎng)第30天。圖2A為對照組，圖2B為實驗組。對照組中為位于視野中央的大量小腸組織細胞或細胞克隆已經(jīng)死亡，實驗組中顯示的是即將形成克隆的細胞。
圖3　培養(yǎng)第38天。圖3A為對照組，圖3B為實驗組。對照組中的小腸組織細胞或細胞克隆已經(jīng)死亡，實驗組中顯示的是一塊較為完整的小腸粘膜組織。
圖4　培養(yǎng)第42天。圖4A為對照組，圖4B為實驗組。對照組中的小腸組織細胞或細胞克隆已經(jīng)死亡，實驗組中顯示的是一塊小腸粘膜組織。