圖5　培養(yǎng)第50天。圖5A為對照組，圖5B為實驗組。對照組中的小腸組織細胞或細胞克隆已經(jīng)死亡，實驗組中顯示的是兩塊小腸粘膜組織。
圖6　培養(yǎng)第85天。圖6A為對照組，圖6B為實驗組。對照組中的小腸組織細胞或細胞克隆已經(jīng)死亡，實驗組中顯示的是一塊小腸粘膜組織。
圖7　培養(yǎng)第90天。圖7A為對照組，圖7B為實驗組。對照組中的小腸組織細胞或細胞克隆已經(jīng)死亡，實驗組中顯示的是大量的分散生長的小腸組織細胞。
圖8　培養(yǎng)第97天。圖8A為對照組，圖8B為實驗組。對照組中的小腸組織細胞或細胞克隆已經(jīng)死亡，實驗組中顯示的是一塊由細胞連接起來的片狀結(jié)構(gòu)。

　　GIC可使離體腸粘膜細胞在培養(yǎng)液中重新連接組合成粘膜組織

　　現(xiàn)在一般均采用Trowell法進行體外小腸粘膜組織的器官型培養(yǎng)，此法從人體或動物經(jīng)口腔取材，取材部位為十二指腸遠端和空腸近端，將取出的粘膜（不可能是純粹的粘膜組織，應(yīng)該還包括粘膜下層、肌層等等，這與我們的做法一致），將粘膜放在金屬網(wǎng)格上，然后粘膜連同網(wǎng)格一起置于多孔培養(yǎng)板中央的孔，其它孔中置入無菌生理鹽水浸泡過的無菌紗布以便保持濕度，蓋好，置入一個密閉容器中，通95%的氧氣和5%的，37培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。這是目前通用的方法。但此法有明顯的缺點，即方法較為繁瑣，取材量有限，一般每次不能多于10塊活組織，多了容易引起胃腸道出血，取材量受到限制，我們現(xiàn)在采用的方法對其進行了很大的簡化，直接從新處死的胚胎動物體內(nèi)獲得無菌小腸粘膜組織，取材過程極容易控制量，也容易控制部位，特別方便快捷。

　　由于體外培養(yǎng)目前還沒有適宜的人工合成培養(yǎng)基，現(xiàn)有的報道體外培養(yǎng)的小腸粘膜組織維持存活時間較短，不管是用RPMI-1640培養(yǎng)基（附加葡萄糖、胰島素、谷氨酰胺和胎牛血清），還是用Trowell培養(yǎng)基（附加胎牛血清），細胞均最多存活24~48小時，之后就會出現(xiàn)退化和死亡，一般很難超過48小時，培養(yǎng)基中如果不加血清，時間更短，6~12小時會退化壞死，由于植塊存活時間短，給實驗者提供的檢測時間也很短，使多項目檢測不可能，只能檢測那些用藥之后立即就出現(xiàn)的反應(yīng)，長期效應(yīng)無法觀察，使實驗受到了很大限制。而在本實驗中我們使用的含有GIC細胞高級培養(yǎng)基直接打破了現(xiàn)有培養(yǎng)基方面的限制，可以長期培養(yǎng)離體腸粘膜組織，可以長期在光鏡下直接觀察GIC對粘膜生長的影響。

　　本實驗中，GIC對腸粘膜組織的細胞保護作用也得到了明顯體現(xiàn)；對于培養(yǎng)過程中觀察到的片狀粘膜組織，之所以能存在很久時間，并且其內(nèi)的細胞生長良好，是GIC對細胞外基質(zhì)的正常代謝產(chǎn)生了影響，細胞外基質(zhì)是維系細胞相互連接的基礎(chǔ)。

　　為什么胃粘膜能夠在這種環(huán)境中長期生長呢？有兩個原因：一是GIC是營養(yǎng)豐富的細胞培養(yǎng)基及良好的細胞保護劑，另一個是腸道粘膜組織中有粘膜上皮干細胞，GIC啟動了干細胞，使干細胞得以較長時間地生長。

　　對于第一個問題的解釋：

　　GIC有效成分中含有的亞油酸是細胞必需的脂肪酸，是構(gòu)成細胞生物膜不可缺少的組分，是皮膚、粘膜及深層組織損傷后進行修復(fù)的重要材料；有效成分中含有的多種氨基酸如蛋氨酸、半胱氨酸、精氨酸、亮氨酸以及多種脂類物質(zhì)、維生素、微量元素，為腸粘膜細胞的生長提供了豐富的營養(yǎng)；有效成分還具有抗病原微生物作用，對多種細菌、病毒、真菌、原生物都有較強的抑制作用，同時具有抗炎作用；藥物中的有效成分還可以促進細胞的能量代謝，蛋白質(zhì)及核酸合成和生物膜轉(zhuǎn)運等功能；緩慢釋放，使細胞持續(xù)得到穩(wěn)定的營養(yǎng)供應(yīng)。

　　GIC的抗氧化作用表現(xiàn)為抗自由基、穩(wěn)定細胞膜。自由基是廣泛存在于各種化學(xué)反應(yīng)中的活潑基團，倘若其產(chǎn)生過量，從而引發(fā)所謂的自由基鏈式反應(yīng)，則將導(dǎo)致細胞膜多不飽和脂肪酸的脂質(zhì)過氧化，所產(chǎn)生的大量脂質(zhì)過氧化物會損傷細胞膜及細胞內(nèi)的大分子蛋白質(zhì)與核酸，對細胞造成損傷。有效成分中維生素E的抗自由基功能是由于其自身結(jié)構(gòu)具有還原性，進而捕捉自由基從而阻斷自由基鏈式反應(yīng)，起到對機體的保護作用，而其自身則經(jīng)過維生素C和含硫氨基酸的再生而還原或轉(zhuǎn)變?yōu)轷惢衔�。大量維生素E的存在可使細胞處于流動性高、通透性嚴密的狀態(tài)。這除了可保護膜上大量的多不飽和脂肪酸不被氧化外，還與其可以保護膜蛋白的活性結(jié)構(gòu)有關(guān)。

　　對于第二個問題的解釋：

　　腸道粘膜組織中有粘膜上皮干細胞，在合適條件下能夠長期生長，GIC有能力啟動干細胞使之活化。腸道粘膜的上皮組織來源于上皮干細胞（epithelial stem cell）， 用-胸腺嘧啶脫氧核苷（-TdR）標記放射自顯影法觀察瞬間標記后的腸腺細胞發(fā)現(xiàn)，上皮干細胞位于或靠近腸隱窩的部位。為了維持動態(tài)平衡，這些干細胞不斷轉(zhuǎn)化為短暫繁殖細胞并向中段移動，最后要么分化為具有吸收功能的刷狀緣上皮細胞，要么分化為腸道內(nèi)分泌細胞。分化后的細胞最后死亡并且從腸絨毛上脫落下來并進入腸腔，任何干細胞都具有生長繁殖的能力，它們是一群分化較低的細胞，這是干細胞與分化細胞明顯的不同，體外培養(yǎng)中最容易增殖的正常細胞是干細胞，干細胞屬于未分化細胞，盡管脫離了體內(nèi)生長的微環(huán)境，但仍然具有較強的增殖能力�？梢詳嘌杂捎贕IC具有激活表皮干細胞的能力，對粘膜干細胞也應(yīng)該有相應(yīng)的激活能力。

　　至于生長的細胞的性質(zhì)，我們認為一定是粘膜細胞，主要原因有兩個：一是因為上皮干細胞在體外有較強的增殖功能，這已經(jīng)為許多研究結(jié)果所證實，腸壁其它細胞均不具備這種能力，本實驗所用的標本中，除粘膜細胞外，數(shù)量最多的應(yīng)該是腸壁的平滑肌細胞，平滑肌細胞在體外可進行有限的增殖，但不能長期增殖。本實驗完全可以排除平滑肌細胞生長的可能性，因為培養(yǎng)自始至終未曾發(fā)現(xiàn)形態(tài)呈條形或梭形、排列呈束狀的平滑肌細胞生長。再次，目前還沒有發(fā)現(xiàn)平滑肌干細胞，這也是平滑肌在體外不易長期生長的重要原因。其它細胞如粘膜下層疏松結(jié)締組織中的動脈、靜脈、淋巴管、神經(jīng)纖維和粘膜下神經(jīng)叢等組織的細胞能如此生長的可能性極小。第二個原因是優(yōu)勢生長的問題，當某種細胞特別容易生長的時候，其它細胞的生長就會受到一定程度的抑制或者完全被抑制，本實驗中腸粘膜細胞在生長中占優(yōu)勢或絕對優(yōu)勢。

參　考　文　獻

　　1. Trier J S. Organ culture of mucosa of human small intestine. Methods in cell biology, Academic Press Inc, 1980; Volume 21B, 365

　　2. 鄒仲之　陳東　尹昕。消化管。在“組織學(xué)”。成令忠 主編。北京：人民衛(wèi)生出版社，1981：1082

　　3. 郭燕世, 王玲, 王志均。油酸鈉對消炎痛引起小鼠胃粘膜損傷的保護作用。 北京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報 1987；3（9）：161

　　4. 楊素娟，郭燕世。油酸對消炎痛引起的胃粘膜損傷大鼠胃粘液分泌的影響。 生理學(xué)報，1985； 37（6）：532

　　5. 孫慶偉，滕敏昌，侯奕，等。江西醫(yī)藥， 1994；29（1）：1

　　6. Kiprono PC， Kaberia F， Keriko JM，et al. The in vitro anti-fungal and anti-bacterial activities of beta-sitosterol from Senecio lyratus (Asteraceae). Z Naturforsch [C], 2000; 55(5): 485

　　7. MacDonald H B. Conjugated linoleic acid and disease prevention: a review of current knowledge. Journal of the American College of Nutrition, 2000;19(20):111s