|
四．討 論
體外器官型植塊培養(yǎng)，對(duì)于檢測(cè)控制疾病和健康過程的多種因子有特別的實(shí)驗(yàn)價(jià)值，因?yàn)樵诖伺囵B(yǎng)環(huán)境中, 原來在體內(nèi)胃腸道環(huán)境中的各種各樣的刺激物、體液因子、植物神經(jīng)等影響因素皆可一一避免。但由于植塊中上皮細(xì)胞之間的聯(lián)系、上皮細(xì)胞與間充質(zhì)之間的聯(lián)系以及結(jié)締組織支持框架沒有發(fā)生任何改變，因此，此時(shí)觀察激素、藥物、血源性因子以及神經(jīng)遞質(zhì)等因素對(duì)粘膜代謝和分泌的直接影響，非常直觀明了，并且能夠允許實(shí)驗(yàn)者直接用來自活體動(dòng)物的腸粘膜組織進(jìn)行培養(yǎng)，以觀察粘膜的生理再生、分泌和上皮代謝等重要生理指標(biāo)。我們采用體外培養(yǎng)法就是為了能夠更直觀地觀察到GIC對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的直接影響，從細(xì)胞水平探討GIC作用的機(jī)理。
Yeomans于1976年報(bào)道了一種胃組織的體外培養(yǎng)方法 ，他用的是18天齡大白鼠的胚胎胃，快速取胃，刀切均分為三段，近端1/3棄去，
中間1/3為胃底部，遠(yuǎn)端1/3為胃竇部，胃竇部及胃底部全層切成極小的碎片（<2mm）。這些植塊粘膜面向上，貼在塑料培養(yǎng)板的底部，水平搖床37 培養(yǎng)3天，設(shè)定搖速，平均約每分鐘使培養(yǎng)液沖洗植塊2次，這是第一種方法。另一種方法是將粘膜放在金屬網(wǎng)格上，然后把粘膜連同網(wǎng)格一起置于多孔培養(yǎng)板中央的孔，其它孔中置入無菌生理鹽水浸泡過的無菌紗布以便保持濕度，蓋好，置入一個(gè)密閉容器中，通95%的氧氣和5%的CO2，37培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。由于上述體外培養(yǎng)方法目前還沒有適宜的培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)者維持體外培養(yǎng)的胃粘膜組織存活時(shí)間普遍較短，一般很難超過48小時(shí)，培養(yǎng)基中如果不加血清，時(shí)間更短，6~12小時(shí)會(huì)退化壞死，盡管他們很注意選用好的培養(yǎng)基（9份DMEM-HEPES加1份NCTC-135，另加10%胎牛血清），但由于植塊存活時(shí)間短，給實(shí)驗(yàn)者提供的檢測(cè)時(shí)間有限，檢測(cè)項(xiàng)目不能設(shè)計(jì)的太多，太多了做不完，時(shí)簡(jiǎn)比較倉(cāng)促，觀察結(jié)果只能觀察那些即刻的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，而不能觀察較長(zhǎng)時(shí)間（或延遲的）才出現(xiàn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。由于上述方法不能為長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)提供穩(wěn)定的培養(yǎng)條件，用這種方法進(jìn)行體外培養(yǎng)人胃腸道的粘膜，形態(tài)完整性和功能穩(wěn)定性僅能維持6~12個(gè)小時(shí)，家兔胃粘膜活性組織最多可有24小時(shí)的穩(wěn)定生理功能，之后就會(huì)出現(xiàn)不可逆漸進(jìn)性退化直至死亡。
含有GIC的培養(yǎng)基直接打破了現(xiàn)有培養(yǎng)條件的限制，可以長(zhǎng)期培養(yǎng)離體胃粘膜組織，便于在光鏡下直接觀察GIC對(duì)胃粘膜生長(zhǎng)的中長(zhǎng)期影響，給粘膜體外培養(yǎng)帶來了一次根本性改變，這在傳統(tǒng)培養(yǎng)基和傳統(tǒng)方法下是不可能實(shí)現(xiàn)的。由于使用了含有GIC培養(yǎng)基，作者實(shí)現(xiàn)了本實(shí)驗(yàn)的目的，本實(shí)驗(yàn)的主要目的就是觀察GIC對(duì)粘膜生長(zhǎng)的影響，此結(jié)果也充分體現(xiàn)了GIC對(duì)胃粘膜組織的細(xì)胞保護(hù)作用。
為什么胃粘膜能夠在這種環(huán)境中長(zhǎng)期生長(zhǎng)呢？可能有兩個(gè)原因：一是GIC本身就是具有豐富而全面營(yíng)養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)基和良好的細(xì)胞保護(hù)劑；另一個(gè)是胃粘膜組織中有粘膜干細(xì)胞，GIC激活了干細(xì)胞，促進(jìn)了干細(xì)胞增殖。
對(duì)于第一個(gè)原因的解釋：
GIC有效成分中含有的亞油酸是細(xì)胞必需的脂肪酸，是構(gòu)成細(xì)胞生物膜不可缺少的組分，是皮膚、粘膜及深層組織損傷后進(jìn)行修復(fù)的重要材料。另外GIC有效成分中還含有蛋氨酸、半胱氨酸、精氨酸、亮氨酸等多種氨基酸以及多種脂類物質(zhì)、維生素、微量元素，為胃粘膜細(xì)胞生長(zhǎng)提供了豐富的營(yíng)養(yǎng)。有效成分具有抗病原微生物作用，對(duì)多種細(xì)菌、病毒、真菌、原生物都有較強(qiáng)的抑制作用，同時(shí)具有抗炎作用。GIC中的有效成分還可以促進(jìn)細(xì)胞的能量代謝、蛋白質(zhì)及核酸合成和生物膜的轉(zhuǎn)運(yùn)等功能。GIC中的緩釋劑成分使其緩慢釋放至培養(yǎng)基，防止?jié)舛冗^高或過低，使細(xì)胞持續(xù)得到恒定的營(yíng)養(yǎng) 。
GIC有效成分中的抗氧化作用對(duì)長(zhǎng)期培養(yǎng)的細(xì)胞的存活極為重要，抗氧化表現(xiàn)為抗自由基、穩(wěn)定細(xì)胞膜。自由基是廣泛存在于各種化學(xué)反應(yīng)中的活潑基團(tuán)，倘若其產(chǎn)生過量，從而引發(fā)所謂的自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，則將導(dǎo)致細(xì)胞膜多不飽和脂肪酸的脂質(zhì)過氧化，所產(chǎn)生的大量脂質(zhì)過氧化物會(huì)損傷細(xì)胞膜及細(xì)胞內(nèi)的大分子蛋白質(zhì)與核酸，對(duì)細(xì)胞造成損傷。GIC有效成分中含有大量的維生素E，維生素E的抗自由基功能是由于其自身結(jié)構(gòu)具有還原性，進(jìn)而捕捉自由基從而阻斷自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，起到對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用，而其自身則經(jīng)過維生素C和含硫氨基酸的再生而還原或轉(zhuǎn)變?yōu)轷惢衔�。大量維生素E的存在可使細(xì)胞處于流動(dòng)性高、通透性嚴(yán)密的狀態(tài)。這除了可保護(hù)膜上大量的多不飽和脂肪酸不被氧化外，還與其可以保護(hù)膜蛋白的活性結(jié)構(gòu)有關(guān)。
對(duì)于第二個(gè)原因的解釋：
胃粘膜組織中有粘膜上皮干細(xì)胞，GIC啟動(dòng)了干細(xì)胞。胃粘膜的上皮組織來源于上皮干細(xì)胞（epithelial stem cell）,
用 -胸腺嘧啶脫氧核苷放射自顯影研究顯示，胃粘膜的上皮干細(xì)胞位于胃小凹底部至胃底腺頸部的細(xì)胞群中 。組織學(xué)顯示胃小凹底部的表面粘液細(xì)胞與胃上皮其它部位的同種細(xì)胞相比，體積稍小，粘原顆粒較少，分化程度較低，具有旺盛的增殖能力。那些喪失分裂能力的子細(xì)胞向小凹上部與粘膜表面不斷移動(dòng)，最終這些細(xì)胞變?yōu)槌墒斓娘柡吃w粒的表面粘液細(xì)胞。細(xì)胞到達(dá)粘膜表面后不久即脫落。新生的細(xì)胞從小凹底部開始向上遷移至脫落需要3~4天的時(shí)間。這些胃粘膜的干細(xì)胞最容易在體外增殖，干細(xì)胞屬于未分化細(xì)胞，盡管脫離了體內(nèi)生長(zhǎng)的微環(huán)境，但仍然具有較強(qiáng)的增殖能力。
至于生長(zhǎng)的細(xì)胞的性質(zhì)，我們認(rèn)為就是胃粘膜細(xì)胞，主要原因有兩個(gè)：一是因?yàn)檎衬ど掀じ杉?xì)胞在體外有較強(qiáng)的增殖功能，在體外可有一定程度的生長(zhǎng)繁殖，這已經(jīng)為許多研究結(jié)果所證實(shí)，胃壁其它細(xì)胞均不具備這種能力，本實(shí)驗(yàn)所用的胃組織標(biāo)本中，除粘膜細(xì)胞外，數(shù)量最多的應(yīng)該是胃壁的平滑肌細(xì)胞，平滑肌細(xì)胞在體外只能進(jìn)行有限的增殖，本實(shí)驗(yàn)完全可以排除平滑肌細(xì)胞生長(zhǎng)的可能性，因?yàn)榕囵B(yǎng)自始至終未曾發(fā)現(xiàn)形態(tài)呈條形或梭形、排列呈束狀的平滑肌細(xì)胞生長(zhǎng)。再次，目前還沒有發(fā)現(xiàn)平滑肌干細(xì)胞，這也被認(rèn)為是平滑肌在體外不易長(zhǎng)期生長(zhǎng)的原因之一。其它細(xì)胞如粘膜下層疏松結(jié)締組織中的動(dòng)脈、靜脈、淋巴管、神經(jīng)纖維和粘膜下神經(jīng)叢等組織的細(xì)胞能如此生長(zhǎng)的可能性很�。坏诙䝼�(gè)原因是優(yōu)勢(shì)生長(zhǎng)的問題，當(dāng)某種細(xì)胞特別容易生長(zhǎng)的時(shí)候，其它細(xì)胞的生長(zhǎng)就會(huì)受到一定程度的抑制或者完全被抑制，本實(shí)驗(yàn)中其它細(xì)胞的生長(zhǎng)完全可以被胃粘膜細(xì)胞旺盛的生長(zhǎng)所抑制。
參 考 文 獻(xiàn)
1. Donaldson R M JR,
Kapadia C R. Organ Culture of gastric mucosa: advantages and limitations.
Academic Press Inc, Methods in cell biology, 1980; Volume 21B, 349
2. 鄒仲之 陳東 尹昕。消化管。在“組織學(xué)”。成令忠 主編。北京：人民衛(wèi)生出版社，1981：1082
3. 郭燕世, 王玲, 王志均。油酸鈉對(duì)消炎痛引起小鼠胃粘膜損傷的保護(hù)作用。北京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào) 1987；3（9）：161
4. 楊素娟，郭燕世。油酸對(duì)消炎痛引起的胃粘膜損傷大鼠胃粘液分泌的影響。 生理學(xué)報(bào)，1985； 37（6）：532
5. 孫慶偉，滕敏昌，侯奕，等。江西醫(yī)藥， 1994；29（1）：1
6. Kiprono PC， Kaberia
F， Keriko JM，et al. The in vitro anti-fungal and anti-bacterial
activities of beta-sitosterol from Senecio lyratus (Asteraceae).
Z Naturforsch [C], 2000; 55(5): 485
7. MacDonald H B. Conjugated
linoleic acid and disease prevention: a review of current knowledge.
Journal of the American College of Nutrition, 2000;19(20):111s
|
